Plasmide CRISPR d'Activation (h) p8: sc-402153-ACT

Le gène humain NUPR1 code la protéine p8, associée à la chromatine et inductible par le stress. Il s’agit d’un petit régulateur intrinsèquement désordonné des programmes transcriptionnels qui coordonnent l’adaptation aux lésions cellulaires. p8 intègre des signaux provenant du stress du réticulum endoplasmique (RE), du stress oxydatif et de la limitation en nutriments afin d’influencer le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, l’autophagie et les réponses aux dommages de l’ADN, via une modulation dépendante du contexte des réseaux de facteurs de transcription. Elle a été associée au remodelage de voies inflammatoires et métaboliques ainsi qu’à des modifications des caractéristiques épithélio-mésenchymateuses, ce qui soutient des rôles dans la plasticité cellulaire. Une activité dérégulée de NUPR1/p8 est fréquemment étudiée en oncologie et dans la physiopathologie liée à l’inflammation, où une tolérance au stress et une signalisation de survie altérées contribuent à des phénotypes pertinents pour la maladie.

p8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NUPR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NUPR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NUPR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NUPR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p8 dans les cellules tumorales présentant une expression de NUPR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.