Plasmide CRISPR d'Activation (h) p70 S6 kinase β: sc-400409-ACT

Le gène humain RPS6KB2 code la p70 S6 kinase β, une kinase sérine/thréonine de la famille AGC qui agit en aval de la signalisation PI3K–AKT–mTOR, reliant les signaux nutritifs et les facteurs de croissance à la synthèse protéique et à la croissance cellulaire. En phosphorylant des substrats impliqués dans l’initiation de la traduction et la biogenèse ribosomale, la p70 S6 kinase β contribue à réguler la taille cellulaire, la prolifération et l’adaptation métabolique lorsque les conditions environnementales changent. La dérégulation de la signalisation mTOR/S6K est fréquemment étudiée dans le contexte des altérations du métabolisme anabolique et des réponses au stress dans le cancer et d’autres troubles prolifératifs, où un contrôle traductionnel aberrant et des boucles de rétroaction peuvent remodeler la dynamique de la voie. L’activité de RPS6KB2 est également pertinente pour l’étude de la signalisation de l’insuline, de la bioénergétique cellulaire et des interactions avec la voie MAPK ainsi qu’avec des processus associés à l’autophagie.

p70 S6 kinase β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPS6KB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p70 S6 kinase β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPS6KB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPS6KB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p70 S6 kinase β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPS6KB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p70 S6 kinase β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p70 S6 kinase β dans les cellules tumorales présentant une expression de RPS6KB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.