p40-phox CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401461-ACT

NCF4 kodiert p40-phox, eine regulatorische Komponente des phagozytären NADPH-Oxidase-(NOX2)-Komplexes, die den Zusammenbau und die Aktivität der Oxidase an Endomembranen und Phagosomen moduliert. Durch Interaktionen mit p67-phox (NCF2), p47-phox (NCF1) und dem membranständigen Cytochrom b558 trägt p40-phox dazu bei, die stimulusabhängige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zu steuern, die die Abtötung von Mikroorganismen und redoxabhängige Signalprozesse unterstützt. Dieser Signalweg ist in angeborene Immunprozesse wie Phagozytose, Inflammasom-Signalgebung und Zytokinantworten eingebunden, wobei eine veränderte Oxidase-Regulation die Wirtsabwehr und die inflammatorische Homöostase stören kann. Eine dysregulierte NOX2-Aktivität und p40-phox-abhängige Signalgebung wurden mit Immundefizienz- und Entzündungsphänotypen in Verbindung gebracht und bieten damit einen mechanistischen Ansatzpunkt zur Untersuchung der Regulation des oxidativen Bursts in myeloiden Zellen.

p40-phox Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NCF4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p40-phox Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NCF4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NCF4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p40-phox-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NCF4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p40-phox-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p40-phox-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NCF4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.