p35 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400431-ACT

Das humane CDK5R1-Gen kodiert p35, eine in Neuronen angereicherte regulatorische Untereinheit, die an die Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) bindet und sie aktiviert und damit eine Kinaseaktivität formt, die für die neuronale Entwicklung und die synaptische Funktion entscheidend ist. Der CDK5–p35-Komplex koordiniert Prozesse wie Neuritenauswuchs, neuronale Migration, Zytoskelett-Umbau sowie aktivitätsabhängige Signalübertragung, indem er Substrate phosphoryliert, die die Mikrotubuli-Dynamik und den Vesikeltransport beeinflussen. Eine gestörte Homöostase von CDK5R1/p35, einschließlich veränderter Proteolyse und aberranter CDK5-Signalgebung, wurde mit neurodegenerativen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird häufig in Modellen für neuronalen Stress und synaptische Dysfunktion untersucht. Als Knotenpunkt, der calciumabhängige Signalwege mit zytoskelettalen und transkriptionellen Outputs verknüpft, bietet p35 einen gut handhabbaren Ansatzpunkt für mechanistische Studien in neuronalen und glialen Systemen.

p35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK5R1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK5R1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK5R1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p35-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK5R1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p35-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p35-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK5R1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.