Plasmide CRISPR d'Activation (m) P2Y9: sc-429620-ACT

Le gène murin **Lpar4** code le récepteur purinergique couplé aux protéines G **P2Y9**, un capteur de surface cellulaire des nucléotides extracellulaires qui s’associe à des protéines G hétérotrimériques afin de moduler la signalisation des seconds messagers. L’activité de P2Y9 peut influencer des voies dépendantes des GPCR telles que la mobilisation du calcium dépendante de la phospholipase C, la régulation de l’AMPc, ainsi que la signalisation MAPK/ERK en aval, façonnant ainsi la communication cellulaire, la migration et les réponses inflammatoires. Comme la signalisation par les nucléotides est étroitement liée au stress tissulaire et à l’activation immunitaire, une signalisation P2Y9/Lpar4 altérée est pertinente pour les études portant sur l’inflammation, la régulation vasculaire et métabolique, ainsi que les modifications de signalisation du microenvironnement observées dans la biologie des maladies.

P2Y9 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Lpar4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P2Y9 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Lpar4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Lpar4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P2Y9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Lpar4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P2Y9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P2Y9 dans les cellules tumorales présentant une expression de Lpar4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.