Plasmide CRISPR/Cas9 KO p14ARF/p16 (h2): sc-400018-KO-2

Présentation

CDKN2A code deux protéines suppresseurs de tumeur, p16INK4A et p14ARF, produites à partir d’exons initiaux alternatifs et de cadres de lecture distincts, qui convergent vers le contrôle du cycle cellulaire et les réponses au stress oncogénique. p16INK4A inhibe CDK4/6 afin de maintenir RB1 dans un état hypophosphorylé, suppresseur de croissance, et de freiner la progression G1–S, tandis que p14ARF antagonise MDM2 pour stabiliser TP53 et favoriser des programmes transcriptionnels dépendants de p53. Par ces nœuds, CDKN2A intègre les signaux mitogènes avec la sénescence, l’apoptose et l’application des points de contrôle, influençant des voies fréquemment altérées dans le cancer. Une perturbation génétique ou épigénétique de CDKN2A est associée à une prolifération dérégulée, à des réponses aux dommages de l’ADN altérées et à une activité modifiée du réseau des suppresseurs de tumeur dans de nombreux contextes tumoraux.

Le p14ARF/p16 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h2) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène CDKN2A dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus CDKN2A, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le p14ARF/p16 plasmide HDR (h2) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible CDKN2A défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide p14ARF/p16 CRISPR/Cas9 KO (h2):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert CDKN2A.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus CDKN2A et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons CDKN2A essentiels à la fonction p14ARF/p16
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.