Plásmido CRISPR de Activación (h) P/Q-type Ca⁺⁺ CP α1A: sc-404267-ACT

CACNA1A codifica la subunidad α1A formadora del poro de los canales de calcio dependientes de voltaje tipo P/Q (CaV2.1), que median la entrada de Ca²⁺ activada a altos voltajes en células excitables. En neuronas, CaV2.1 está enriquecido en las zonas activas presinápticas, donde acopla la despolarización de la membrana con la fusión de vesículas sinápticas dependiente de Ca²⁺, modulando la probabilidad de liberación de neurotransmisores, la plasticidad a corto plazo y la excitabilidad de la red. La actividad del canal se integra con vías de señalización reguladas por Ca²⁺, incluida la modulación dependiente de calmodulina, la fosforilación por PKA/PKC y programas transcripcionales posteriores sensibles a la dinámica intracelular de Ca²⁺. La variación genética o la desregulación de CACNA1A se asocia con fenotipos neurológicos que involucran circuitos cerebelosos y corticales, lo que respalda su uso en estudios de fisiología sináptica y mecanismos del neurodesarrollo.

P/Q-type Ca++ CP α1A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CACNA1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

P/Q-type Ca++ CP α1A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CACNA1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CACNA1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de P/Q-type Ca++ CP α1A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CACNA1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de P/Q-type Ca++ CP α1A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía P/Q-type Ca++ CP α1A en células tumorales con expresión de CACNA1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.