Plasmide CRISPR d'Activation (h) OST48: sc-403323-ACT

DDOST code pour OST48, une sous-unité essentielle du complexe oligosaccharyltransférase (OST) du réticulum endoplasmique rugueux, qui catalyse la glycosylation N liée, co-traductionnelle, des protéines sécrétoires et membranaires naissantes. En soutenant la maturation des glycoprotéines et le contrôle qualité, OST48 relie la biogenèse des protéines à la protéostasie du RE, à la signalisation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et aux voies de dégradation associée au RE (ERAD). Une N‑glycosylation altérée peut perturber le trafic des récepteurs, la communication cellule–cellule et la reconnaissance immunitaire, et la dérégulation de DDOST a été étudiée dans des contextes où le remodelage du glycoprotéome et le stress du RE sont des caractéristiques marquantes. En tant que composant constitutif de la machinerie OST, DDOST est fréquemment utilisé pour examiner comment la capacité de glycosylation influence la signalisation des voies et la viabilité cellulaire.

OST48 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDOST sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OST48 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDOST dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDOST, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OST48. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDOST natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OST48 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OST48 dans les cellules tumorales présentant une expression de DDOST silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.