Plasmide CRISPR d'Activation (h) ORMDL2: sc-403585-ACT

ORMDL2 (orosomucoïde-like 2) est une protéine membranaire du réticulum endoplasmique qui participe à l’homéostasie des sphingolipides en modulant l’activité de la sérine palmitoyltransférase et en équilibrant la synthèse des céramides et de la sphingomyéline. Par ce rôle, ORMDL2 influence la composition de la membrane du RE, la gestion du calcium et la signalisation du stress du RE, reliant le métabolisme lipidique à la protéostase et aux réponses inflammatoires. Une régulation altérée de la famille ORMDL a été associée à l’inflammation des voies aériennes, à des traits liés à l’asthme et à des phénotypes immunométaboliques plus larges, faisant d’ORMDL2 une cible utile pour étudier la signalisation induite par les lipides dans les cellules humaines. Sa position à l’interface entre la biosynthèse des sphingolipides et les voies de réponse au stress soutient des recherches mécanistiques sur la manière dont les flux lipidiques du RE façonnent les fonctions de l’immunité innée et de barrière.

ORMDL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ORMDL2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ORMDL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ORMDL2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ORMDL2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ORMDL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ORMDL2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ORMDL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ORMDL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ORMDL2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.