Plasmide CRISPR d'Activation (h) ORC2: sc-402746-ACT

L’ORC2 humain code une sous-unité centrale du complexe de reconnaissance de l’origine de réplication (ORC), qui se fixe aux origines de réplication et coordonne l’assemblage du complexe de pré-réplication afin d’assurer une synthèse de l’ADN une seule fois par cycle cellulaire. ORC2 agit à l’interface entre la régulation de la chromatine et l’octroi de licence de réplication, en s’intégrant à CDC6, CDT1 et au chargement de l’hélicase MCM durant la phase G1, et en favorisant l’entrée en phase S ainsi que la stabilité du génome. Une altération de l’activité d’ORC2 peut perturber le calendrier de réplication et la progression des fourches, augmentant le stress réplicatif et les réponses aux dommages de l’ADN, fréquemment mobilisées dans les troubles prolifératifs. En tant que déterminant majeur de la compétence des origines de réplication, ORC2 est largement étudié dans le contrôle du cycle cellulaire, le métabolisme de l’ADN associé à la chromatine et les mécanismes qui préservent l’intégrité génomique.

ORC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ORC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ORC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ORC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ORC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ORC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ORC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ORC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ORC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ORC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.