ORC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402746-ACT

Humanes ORC2 kodiert eine zentrale Untereinheit des Origin-Recognition-Complexes (ORC), der an Replikationsursprünge bindet und den Aufbau des Prä-Replikationskomplexes koordiniert, um eine einmalige DNA-Synthese pro Zellzyklus sicherzustellen. ORC2 wirkt an der Schnittstelle zwischen Chromatinregulation und Replikationslizenzierung, integriert sich während der G1-Phase in die Abläufe mit CDC6, CDT1 und dem Laden der MCM-Helikase und unterstützt so den Eintritt in die S-Phase sowie die Genomstabilität. Eine Störung der ORC2-Aktivität kann das Replikationstiming und den Fortschritt der Replikationsgabel beeinträchtigen, wodurch Replikationsstress und DNA-Schadensantworten zunehmen, die bei proliferativen Erkrankungen häufig aktiviert sind. Als zentraler Bestimmungsfaktor für die Funktionsfähigkeit von Replikationsursprüngen wird ORC2 breit in der Zellzykluskontrolle, dem chromatinassoziierten DNA-Stoffwechsel und den Mechanismen untersucht, die die genomische Integrität schützen.

ORC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ORC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ORC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ORC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ORC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ORC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ORC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ORC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ORC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ORC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.