Plásmido CRISPR de Activación (h) OPG/Osteoprotegerin: sc-400497-ACT

TNFRSF11B codifica la osteoprotegerina (OPG), un receptor señuelo secretado de la superfamilia de receptores del TNF que se une a RANKL (TNFSF11) y limita la señalización RANK–RANKL, modulando así la diferenciación de los osteoclastos y la remodelación ósea. Al secuestrar RANKL y ligandos relacionados, la OPG influye en la activación posterior de las vías NF-κB y MAPK en los precursores de osteoclastos y contribuye al acoplamiento entre la actividad de osteoblastos y osteoclastos. Más allá de la biología esquelética, la OPG se ha implicado en procesos vasculares e inmunitarios mediante la regulación de la señalización de citocinas y de señales del microambiente extracelular. La expresión desregulada de TNFRSF11B/OPG se asocia con fenotipos de recambio óseo alterado y se ha estudiado en contextos que incluyen la osteoporosis, mecanismos de enfermedad osteolítica y la patobiología relacionada con la calcificación.

OPG/Osteoprotegerin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TNFRSF11B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

OPG/Osteoprotegerin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TNFRSF11B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TNFRSF11B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de OPG/Osteoprotegerin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TNFRSF11B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de OPG/Osteoprotegerin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía OPG/Osteoprotegerin en células tumorales con expresión de TNFRSF11B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.