Plasmide CRISPR d'Activation (h) Occludin: sc-418271-ACT

L’OCLN humain code l’occludine, un composant membranaire intégral des brins de jonctions serrées, qui régule la perméabilité de la barrière paracellulaire et la polarité des cellules épithéliales. L’occludine participe à l’assemblage et au remodelage des jonctions via des interactions avec les protéines d’échafaudage ZO et des connexions au cytosquelette d’actine, intégrant des signaux issus des voies des GTPases Rho, de la PKC et des MAPK. Son état de phosphorylation influence la stabilité des jonctions serrées, l’adhérence cellule–cellule et les réponses aux signaux inflammatoires. Une expression ou une localisation dérégulée d’OCLN est associée à des défauts de barrière et contribue à des modèles de recherche sur l’inflammation intestinale et des voies respiratoires, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la transition épithélio-mésenchymateuse.

Occludin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OCLN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Occludin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OCLN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OCLN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Occludin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OCLN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Occludin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Occludin dans les cellules tumorales présentant une expression de OCLN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.