OATP8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402371-ACT

SLCO1B3 kodiert das humane organische Anionentransportpolypeptid OATP8 (OATP1B3), einen membranständigen Aufnahmetransporter, der die natriumunabhängige Aufnahme verschiedenster endogener und xenobiotischer organischer Anionen vermittelt. Es ist von hoher Bedeutung für hepatische und epitheliale Transportprozesse, die die zelluläre Exposition gegenüber Gallensäuren, Bilirubinkonjugaten, Steroidhormonmetaboliten und zahlreichen arzneistoffähnlichen Verbindungen prägen und damit Entgiftungs- sowie metabolische Eliminationswege beeinflussen. Eine veränderte SLCO1B3-Expression oder Fehl-Lokalisierung kann die intrazelluläre Verfügbarkeit von Substraten und nachgeschaltete Signalwege im Zusammenhang mit Xenobiotikaantwort, Umgang mit oxidativem Stress und metabolischer Homöostase umgestalten. Eine abweichende OATP1B3-Aktivität und ektope Expressionsmuster wurden bei mehreren Krebsarten und leberassoziierten Erkrankungen beschrieben, wodurch es ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zu transporterregulierten Phänotypen und pharmakogenomischer Variabilität darstellt.

OATP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLCO1B3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OATP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLCO1B3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLCO1B3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OATP8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLCO1B3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OATP8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OATP8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLCO1B3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.