Plasmide CRISPR d'Activation (h) O-GlcNAc transferase: sc-400717-ACT

L’OGT humain code l’O-GlcNAc transférase, l’enzyme centrale qui catalyse la modification O‑GlcNAc (β‑N‑acétylglucosamine liée en O) des résidus sérine/thréonine des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Cette modification post‑traductionnelle dynamique intègre la détection des nutriments via la voie de biosynthèse des hexosamines à la régulation transcriptionnelle, au remodelage de la chromatine, au contrôle du cycle cellulaire et à la signalisation des réponses au stress. L’O‑GlcNAcylation dépendante d’OGT module des régulateurs clés, notamment l’ARN polymérase II, c‑Myc, p53 et NF‑κB, façonnant la protéostasie et le dialogue des voies de signalisation avec la phosphorylation. Une activité d’OGT dérégulée et des altérations globales du cycle O‑GlcNAc ont été associées à la biologie des cancers, aux dysfonctionnements métaboliques, à la neurodégénérescence et à une signalisation immunitaire perturbée, soulignant sa large pertinence pour les études mécanistiques.

O-GlcNAc transferase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OGT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

O-GlcNAc transferase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OGT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OGT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de O-GlcNAc transferase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OGT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de O-GlcNAc transferase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie O-GlcNAc transferase dans les cellules tumorales présentant une expression de OGT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.