Plasmide CRISPR d'Activation (m) NUMB: sc-421991-ACT

NUMB chez la souris est une protéine adaptatrice de l’endocytose qui agit comme déterminant du destin cellulaire en régulant la division cellulaire asymétrique et le trafic des récepteurs. Elle antagonise la signalisation Notch et module des voies liées à l’ubiquitination et à l’endocytose, influençant ainsi la prolifération, la différenciation et le maintien des cellules souches/progénitrices dans de multiples tissus. NUMB s’inscrit aussi dans les programmes de polarité et d’adhésion via des interactions avec la machinerie endocytaire et des complexes de signalisation, façonnant la mise en place des patrons développementaux et les décisions de lignage neuronal. Une expression ou une activité dérégulée de NUMB a été associée à des états de différenciation altérés et à des réseaux de signalisation liés aux tumeurs, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de voies pertinentes pour le développement et la maladie.

NUMB Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Numb sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NUMB Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Numb dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Numb, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NUMB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Numb natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NUMB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NUMB dans les cellules tumorales présentant une expression de Numb silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.