Plasmide CRISPR d'Activation (m) NUDT8: sc-425987-ACT

Chez la souris, Nudt8 code NUDT8, un membre de la famille des hydrolases Nudix qui catalyse l’hydrolyse de dérivés de nucléosides diphosphates afin de préserver la qualité du pool de nucléotides et de limiter l’accumulation de métabolites potentiellement toxiques. En contrôlant les niveaux d’espèces nucléotidiques oxydées ou aberrantes, NUDT8 contribue à l’homéostasie métabolique et aide à protéger les acides nucléiques contre la mauvaise incorporation et les dommages. Les enzymes Nudix sont souvent associées aux réponses au stress cellulaire, à l’équilibre rédox et à l’intégrité de l’ADN/ARN, ce qui rend l’expression et la régulation de Nudt8 pertinentes pour les études sur la stabilité du génome et la signalisation liée à l’inflammation. Les voies de « sanitation » (assainissement) des nucléotides altérées sont fréquemment étudiées dans le contexte de la biologie du cancer, de la neurodégénérescence et des dérégulations métaboliques, où des modifications du renouvellement des nucléotides peuvent influencer la charge mutationnelle et les programmes de survie cellulaire.

NUDT8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nudt8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NUDT8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nudt8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nudt8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NUDT8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nudt8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NUDT8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NUDT8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Nudt8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.