Plasmide CRISPR d'Activation (h) NTR1: sc-402552-ACT

Le récepteur 1 de la neurotensine (NTSR1/NTR1) est un GPCR de classe A qui se couple principalement à Gq/11 et peut également engager une signalisation dépendante de la β-arrestine, reliant la liaison de la neurotensine à l’activation de la phospholipase C, à la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et à la sortie de la voie MAPK/ERK. Par ces cascades, NTR1 influence la neurotransmission, la sécrétion endocrine, la contractilité des muscles lisses, ainsi que la régulation des programmes de prolifération et de survie cellulaires. L’expression et la signalisation de NTSR1 ont été étudiées dans des contextes d’excitabilité neuronale altérée, de signalisation inflammatoire et de dialogue entre voies oncogéniques, où l’activité MAPK et PI3K/AKT induite par le récepteur peut moduler les transitions d’état cellulaire. Ces caractéristiques font de NTSR1 un nœud utile pour étudier les programmes transcriptionnels pilotés par les GPCR, la désensibilisation/internalisation des récepteurs et le remodelage des voies de signalisation dans des modèles pertinents pour les maladies.

NTR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NTSR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NTR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NTSR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NTSR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NTR1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NTSR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NTR1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NTR1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NTSR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.