NSF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402258-ACT

NSF (N‑ethylmaleimid‑sensitiver Faktor) kodiert eine AAA+-ATPase, die nach der Membranfusion cis‑SNARE‑Komplexe auseinanderbaut und dadurch SNAREs für wiederholte Runden des vesikulären Transports regeneriert. Diese Aktivität ist zentral für den intrazellulären Transport, einschließlich Exozytose, Endozytose und synaptischem Vesikelzyklus, und unterstützt die Organelldynamik entlang der sekretorischen und endolysosomalen Wege. Indem NSF das Andocken von Vesikeln sowie die Effizienz von Fusionen steuert, beeinflusst es Neurotransmission, Sekretion und den Umsatz von Membranproteinen – Prozesse, die häufig bei neurologischen und anderen Erkrankungen gestört sind, in denen Proteostase und Transportmechanismen beeinträchtigt sind. Eine fehlregulierte Vesikelfusionsmaschinerie kann die Zellsignalgebung und Stressantworten verändern, wodurch NSF ein relevanter Knotenpunkt für mechanistische Studien zu Phänotypen des Membrantransports ist.

NSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NSF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NSF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NSF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NSF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NSF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NSF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NSF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NSF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.