Plasmide CRISPR d'Activation (h) NRSF: sc-418578-ACT

Le facteur de transcription silencieux RE1 (REST), également appelé facteur silencieux restrictif neuronal (NRSF), est un répresseur transcriptionnel à doigts de zinc qui se lie aux éléments RE1/NRSE afin de réguler de vastes réseaux géniques contrôlant la différenciation neuronale, la fonction synaptique et la transcription dépendante de l’activité. En recrutant des complexes corépresseurs tels que CoREST, des HDAC et des enzymes modifiant la chromatine, REST façonne les états épigénétiques et module les programmes de maturation de l’ARN dans des contextes neuraux et non neuraux. La régulation dépendante de REST s’entrecroise avec le remodelage de la chromatine, l’expression des canaux ioniques et les voies de réponse au stress qui influencent les décisions de destinée cellulaire et l’excitabilité. Une activité REST/NRSF dérégulée a été impliquée dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs ainsi que dans la biologie tumorale, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour étudier la répression transcriptionnelle et les circuits de gènes neuronaux dans des cellules humaines.

NRSF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de REST sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NRSF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus REST dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription REST, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NRSF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus REST natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NRSF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NRSF dans les cellules tumorales présentant une expression de REST silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.