Plasmide CRISPR d'Activation (h) NRAMP 2: sc-418176-ACT

Le gène humain SLC11A2 code pour NRAMP2 (également connu sous le nom de DMT1), un transporteur de métaux divalents couplé aux protons qui assure l’entrée cellulaire du fer ferreux et d’autres métaux de transition à travers les membranes endosomales et la membrane plasmique. En contrôlant l’afflux de fer depuis les endosomes contenant de la transferrine ainsi que les voies d’absorption d’origine alimentaire, NRAMP2 contribue à maintenir la disponibilité cytosolique en fer nécessaire à la synthèse de l’hème, à la respiration mitochondriale et à la biogenèse des complexes fer‑soufre, tout en influençant l’équilibre rédox. Une perturbation de l’activité de SLC11A2 modifie l’homéostasie du fer et la signalisation liée au stress oxydatif, avec une pertinence démontrée pour des troubles du métabolisme du fer tels que l’anémie microcytaire et des phénotypes de surcharge systémique en fer. La fonction de NRAMP2 est également étudiée dans le contexte de la gestion des métaux par les macrophages et de la vulnérabilité neuronale liée à un stress cellulaire dépendant du fer.

NRAMP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC11A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NRAMP 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC11A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC11A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NRAMP 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC11A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NRAMP 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NRAMP 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC11A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.