Plasmide CRISPR d'Activation (h) NPR-B: sc-401861-ACT

NPR2 code le récepteur B des peptides natriurétiques (NPR‑B), une guanylate cyclase membranaire qui se lie au peptide natriurétique de type C pour produire du GMPc et activer une signalisation en aval dépendante de la PKG. Cette voie régule l’ossification endochondrale, la prolifération et la différenciation des chondrocytes, ainsi qu’un contrôle plus large des programmes de croissance cellulaire via la modulation, médiée par le GMPc, du transport ionique et des réponses transcriptionnelles. La signalisation NPR2 s’insère dans les réseaux du développement squelettique et dans l’homéostasie de la plaque de croissance, et toute perturbation génétique ou fonctionnelle est associée à des troubles de la croissance linéaire et de la biologie du cartilage. Outre les phénotypes du développement, une altération de la signalisation peptide natriurétique–GMPc est pertinente pour l’étude de la régulation du tonus vasculaire et du remodelage tissulaire dans des modèles cellulaires humains.

NPR-B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPR2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPR-B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPR2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPR2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPR-B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPR2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPR-B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPR-B dans les cellules tumorales présentant une expression de NPR2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.