Plasmide CRISPR d'Activation (m) NPAT: sc-434105-ACT

Le gène murin *Npat* code NPAT, un cofacteur nucléaire qui relie la progression du cycle cellulaire à la transcription des gènes d’histones et à la dynamique de la chromatine. NPAT est activée en aval de cycline E/CDK2 et se localise aux « histone locus bodies », où elle soutient l’expression, couplée à la phase S, des histones dépendantes de la réplication et coordonne la réplication de l’ADN ainsi que le maintien du génome. Par ces fonctions, NPAT contribue à des voies qui gouvernent la transition G1/S, l’incorporation des nucléotides et l’assemblage de la chromatine, des processus fréquemment perturbés lors de stress prolifératif et de changements d’état cellulaire associés à des maladies. Moduler l’expression de *Npat* est donc utile pour disséquer la manière dont la signalisation du cycle cellulaire s’articule avec des programmes transcriptionnels qui contrôlent la stabilité du génome.

NPAT Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Npat sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPAT Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Npat dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Npat, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPAT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Npat natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPAT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPAT dans les cellules tumorales présentant une expression de Npat silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.