NPAS4 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-432569-LAC

Il gene murino Npas4 codifica NPAS4, un fattore di trascrizione bHLH-PAS dipendente dall’attività che collega l’eccitazione neuronale a programmi genici che controllano lo sviluppo delle sinapsi inibitorie e l’equilibrio tra eccitazione e inibizione. NPAS4 è indotto dalla segnalazione del calcio e partecipa a reti trascrizionali che modellano la plasticità sinaptica, il raffinamento dei circuiti e le risposte omeostatiche alle alterazioni dell’attività neuronale. Attraverso la regolazione di bersagli a valle legati alla modulazione delle sinapsi GABAergiche e alla trascrizione dipendente dagli stimoli, NPAS4 influenza la responsività allo stress, la plasticità correlata all’apprendimento e l’adattamento metabolico nei tessuti neurali. Vie associate a NPAS4 deregolate sono state studiate nel contesto dei meccanismi di malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative, inclusi cambiamenti dell’eccitabilità di rete e compromissione della funzione cognitiva.

Le particelle di attivazione lentivirale NPAS4 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Npas4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NPAS4 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Npas4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NPAS4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Npas4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.