Nodal Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401439-ACT

Il gene umano **NODAL** codifica per il morfogeno secreto Nodal, un ligando della superfamiglia **TGF-β** che segnala attraverso i recettori dell’activina e **SMAD2/3** per regolare la specificazione dei foglietti germinativi, la formazione degli assi e il mantenimento dei programmi trascrizionali dello sviluppo. L’attività di Nodal è strettamente controllata da circuiti di feedback con antagonisti come le proteine **LEFTY** e da interazioni con le vie **WNT** e **FGF**, che plasmano le decisioni di destino cellulare e le transizioni epitelio-mesenchimali. La riattivazione aberrante della via di NODAL è stata associata a stati di differenziamento alterati e a fenotipi invasivi in molteplici contesti tumorali, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico in modelli di sviluppo e di malattia. In quanto ligando di via di segnalazione, Nodal fornisce un readout facilmente interrogabile per studiare la segnalazione paracrina, la trascrizione dipendente da SMAD e la plasticità di linea in sistemi cellulari umani.

Nodal Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NODAL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nodal Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NODAL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NODAL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nodal. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NODAL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nodal nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nodal nelle cellule tumorali con espressione di NODAL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.