Plasmide CRISPR d'Activation (h) NNMT: sc-403192-ACT

La NNMT (nicotinamide N‑méthyltransférase) humaine est une méthyltransférase cytosolique qui catalyse la N‑méthylation de la nicotinamide et de pyridines apparentées à partir de la S‑adénosyl‑L‑méthionine, établissant un lien entre le métabolisme des xénobiotiques et l’homéostasie des donneurs de méthyle. En influençant l’équilibre SAM/SAH et les flux métaboliques liés à la nicotinamide et au NAD⁺, la NNMT peut moduler la capacité de méthylation épigénétique et, plus largement, l’état métabolique. Une expression altérée de la NNMT a été associée à une reprogrammation métabolique ainsi qu’à des changements de différenciation cellulaire et de réponses au stress dans de nombreux contextes pathologiques, ce qui en fait un nœud d’intérêt pour étudier le couplage entre métabolisme et épigénome. La NNMT est donc fréquemment étudiée dans des voies liées au métabolisme à un carbone, à la régulation redox et au contrôle transcriptionnel.

NNMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NNMT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NNMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NNMT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NNMT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NNMT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NNMT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NNMT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NNMT dans les cellules tumorales présentant une expression de NNMT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.