Plasmide CRISPR d'Activation (h) NMNAT-1: sc-403085-ACT

NMNAT1 code la nicotinamide mononucléotide adénylyltransférase 1 (NMNAT-1), une enzyme nucléaire qui catalyse la dernière étape de la biosynthèse du NAD⁺ à partir du NMN et de l’ATP. En maintenant les réserves nucléaires de NAD⁺, NMNAT-1 soutient des processus dépendants du NAD⁺, notamment les réponses aux dommages de l’ADN médiées par PARP, la dynamique de la chromatine régulée par les sirtuines, ainsi qu’une signalisation métabolique plus large reliant le maintien du génome à l’adaptation au stress cellulaire. Une altération de la fonction de NMNAT1 a été associée à des phénotypes rétiniens et neurodégénératifs, et fait l’objet d’études fréquentes dans des contextes où l’homéostasie du NAD⁺ influence la viabilité cellulaire sous stress génotoxique ou oxydatif. NMNAT1 est donc pertinent pour la recherche sur le métabolisme du NAD⁺, l’équilibre rédox nucléaire et les interactions entre les voies de réparation de l’ADN et la régulation transcriptionnelle.

NMNAT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NMNAT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NMNAT-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NMNAT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NMNAT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NMNAT-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NMNAT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NMNAT-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NMNAT-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NMNAT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.