Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nkx-2.5: sc-400276-ACT

NKX2-5 code le facteur de transcription à homéoboîte Nkx-2.5, un régulateur central de la cardiogenèse qui contrôle la spécification des progéniteurs cardiaques, la morphogenèse des cavités et le développement du système de conduction. Nkx-2.5 s’intègre aux réseaux GATA4, TBX5 et MEF2 pour moduler la chromatine et les programmes transcriptionnels qui gouvernent l’assemblage des sarcomères, la gestion du calcium et la différenciation des cardiomyocytes. Une activité ou une expression dérégulée de NKX2-5 est associée à des cardiopathies congénitales et à des anomalies de conduction cardiaque, ce qui en fait un nœud clé pour étudier la régulation transcriptionnelle de l’engagement de la lignée cardiaque. Dans des modèles cellulaires humains, la perturbation de NKX2-5 constitue un point d’entrée accessible pour disséquer les circuits de régulation génique du développement et des phénotypes électrophysiologiques pertinents pour la maladie.

Nkx-2.5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NKX2-5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nkx-2.5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NKX2-5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NKX2-5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nkx-2.5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NKX2-5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nkx-2.5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nkx-2.5 dans les cellules tumorales présentant une expression de NKX2-5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.