Plasmide CRISPR d'Activation (h) NKD1: sc-406642-ACT

NKD1 (Naked cuticle homolog 1) est un régulateur cytoplasmique de la signalisation Wnt/β-caténine, qui se lie aux protéines Dishevelled et agit via une rétroaction négative pour moduler l’intensité de la voie. En atténuant la propagation du signal dépendante de Dishevelled, NKD1 influence les programmes transcriptionnels médiés par la β-caténine qui contrôlent les décisions de destinée cellulaire, la prolifération et la différenciation épithéliale. Des altérations de l’expression de NKD1 ont été rapportées dans des contextes de dérégulation de la voie Wnt, une caractéristique de multiples cancers et de troubles du développement. En tant que cible et modulateur répondant à l’activité de la voie, NKD1 est fréquemment utilisé pour étudier la dynamique de la signalisation Wnt et les circuits de rétroaction transcriptionnelle.

NKD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NKD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NKD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NKD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NKD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NKD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NKD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NKD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NKD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NKD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.