Plasmide CRISPR/Cas9 KO Nicotinic Acetylcholine Receptor beta 1/CHRNB1 (m): sc-418957

Présentation

Chrnb1 code la sous-unité β1 du récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAChR) de type musculaire, un canal ionique pentamérique ligand-dépendant qui convertit la liaison de l’acétylcholine en une entrée rapide de cations afin d’initier la dépolarisation à la jonction neuromusculaire. Dans le muscle squelettique de la souris, CHRNB1 soutient l’assemblage du récepteur, son trafic et la stabilisation synaptique, contribuant à la maturation de la plaque motrice et au couplage excitation–contraction. La signalisation du nAChR s’intègre aux voies agrine–LRP4–MuSK et aux processus en aval de remodelage du cytosquelette qui maintiennent l’architecture post-synaptique. L’altération ou la dérégulation de CHRNB1 est pertinente dans des modèles de syndromes myasthéniques congénitaux, de défauts de transmission neuromusculaire et de mécanismes contribuant à la vulnérabilité synaptique associée à la myasthénie grave.

Le Nicotinic Acetylcholine Receptor beta 1/CHRNB1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Chrnb1 dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Chrnb1, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Nicotinic Acetylcholine Receptor beta 1/CHRNB1 plasmide HDR (m) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Chrnb1 défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Nicotinic Acetylcholine Receptor beta 1/CHRNB1 CRISPR/Cas9 KO (m):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Chrnb1.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Chrnb1 et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons Chrnb1 essentiels à la fonction Nicotinic Acetylcholine Receptor beta 1/CHRNB1
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.