Plasmide CRISPR d'Activation (h) NHE-1: sc-400748-ACT

SLC9A1 code l’échangeur Na+/H+ 1 humain (NHE‑1), un antiporteur de la membrane plasmique qui expulse les H+ intracellulaires en échange de Na+ extracellulaire afin de maintenir le pH cytosolique, de réguler le volume cellulaire et de soutenir l’homéostasie ionique. L’activité de NHE‑1 s’articule avec la signalisation des facteurs de croissance et le remodelage du cytosquelette pour influencer la prolifération, la migration et l’adaptation au stress, et elle contribue au contrôle du métabolisme et de l’activité enzymatique dépendant du pH. Un dérèglement de la fonction de NHE‑1 et de l’homéostasie du pH a été associé à des programmes modifiés de survie et de motilité cellulaires en biologie du cancer, ainsi qu’à des mécanismes de lésions liées à l’ischémie en recherche cardiovasculaire et neurologique. Parce que NHE‑1 couple le transport ionique à des sorties de signalisation, SLC9A1 est fréquemment étudié dans des voies impliquant MAPK/ERK, les GTPases Rho et les réponses cellulaires à l’hypoxie et au stress oxydatif.

NHE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC9A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NHE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC9A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC9A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NHE-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC9A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NHE-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NHE-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC9A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.