Plasmide CRISPR d'Activation (h) NGF: sc-400292-ACT

Le facteur de croissance nerveuse (NGF) est une neurotrophine sécrétée qui régule la survie neuronale, la différenciation et la croissance des neurites via la signalisation de haute affinité NTRK1/TrkA et de faible affinité p75NTR. La liaison de NGF active les voies MAPK/ERK, PI3K–AKT et PLCγ afin de coordonner des programmes transcriptionnels impliqués dans la plasticité synaptique, le maintien axonal et les réponses au stress. Au-delà du système nerveux, NGF peut moduler les interactions neuro-immunes et la sensibilisation liée à la douleur en influençant l’excitabilité des neurones périphériques et le dialogue avec les médiateurs inflammatoires. Une signalisation NGF dérégulée a été impliquée dans des processus neurodégénératifs, des mécanismes de douleur chronique et une homéostasie altérée des neurotrophines dans des modèles de lésion et de neuroinflammation.

NGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NGF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NGF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NGF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NGF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NGF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NGF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NGF dans les cellules tumorales présentant une expression de NGF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.