Plasmide CRISPR d'Activation (h) NFS1: sc-403102-ACT

Le gène humain NFS1 code une désulfurase de cystéine qui mobilise le soufre à partir de la L‑cystéine afin de soutenir la biogenèse des clusters fer‑soufre (Fe–S) dans les mitochondries, en agissant avec des protéines partenaires au sein de la machinerie centrale d’assemblage. En permettant la maturation d’enzymes dépendantes des Fe–S, NFS1 influence la phosphorylation oxydative, le métabolisme mitochondrial dépendant de l’acide lipoïque et l’homéostasie rédox, avec des effets en aval sur la réplication et la réparation de l’ADN ainsi que sur les réponses cellulaires au stress. Une perturbation de l’assemblage des clusters Fe–S peut altérer la fonction de la chaîne respiratoire et l’activité d’enzymes métaboliques, reliant les voies régulées par NFS1 à des dysfonctionnements mitochondriaux et à des phénotypes de stabilité du génome étudiés dans divers contextes pertinents pour les maladies. En tant que nœud central de la biosynthèse des cofacteurs mitochondriaux, NFS1 est fréquemment étudié dans des modèles de vulnérabilité métabolique, de stress oxydant et d’états prolifératifs altérés.

NFS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NFS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NFS1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NFS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NFS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NFS1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NFS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NFS1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NFS1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NFS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.