Plasmide CRISPR d'Activation (h) NF-L: sc-402254-ACT

NEFL code la protéine de chaîne légère des neurofilaments (NF‑L), un composant central des filaments intermédiaires qui s’assemble avec d’autres sous-unités de neurofilaments pour maintenir le calibre axonal, la stabilité mécanique et un transport efficace sur de longues distances dans les neurones. La dynamique de NF‑L est couplée au remodelage du cytosquelette, au guidage axonal et à une organisation des filaments dépendante de la phosphorylation, qui soutient l’intégrité neuronale et la connectivité synaptique. Une expression altérée de NEFL ou une perturbation du réseau de neurofilaments est associée à la neurodégénérescence et aux neuropathies périphériques, et l’abondance de NF‑L est largement utilisée en recherche comme indicateur de lésion neuronale et de dégénérescence axonale dans des systèmes modèles. Ces caractéristiques font de NEFL une cible pertinente pour étudier la régulation du cytosquelette, les voies de maintien des axones et les mécanismes qui influencent la résilience neuronale.

NF-L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEFL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NF-L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEFL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEFL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NF-L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEFL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NF-L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NF-L dans les cellules tumorales présentant une expression de NEFL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.