Plasmide CRISPR d'Activation (h) Neutrophil Elastase: sc-400677-ACT

ELANE code l’élastase des neutrophiles, une sérine protéase stockée dans les granules azurophiles, qui est libérée lors de la dégranulation et de la formation de pièges extracellulaires des neutrophiles (NET) afin de remodeler la matrice extracellulaire et de dégrader des protéines microbiennes et de l’hôte. Son activité contribue à la signalisation de l’immunité innée en sculptant les gradients de chimiokines et en modulant des médiateurs inflammatoires, avec une régulation étroite par des antiprotéases endogènes pour éviter des lésions tissulaires collatérales. Une expression ou une activité dérégulée de l’élastase neutrophile est impliquée dans des dommages tissulaires inflammatoires et des interactions hôte–pathogène altérées, et des variants d’ELANE ont été associés à des phénotypes de neutropénie héréditaire affectant la granulopoïèse. En conséquence, ELANE est fréquemment étudié dans des modèles de différenciation myéloïde, d’équilibre protéase–antiprotéase et de pathologies inflammatoires.

Neutrophil Elastase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ELANE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Neutrophil Elastase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ELANE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ELANE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Neutrophil Elastase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ELANE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Neutrophil Elastase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Neutrophil Elastase dans les cellules tumorales présentant une expression de ELANE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.