Plasmide CRISPR d'Activation (h) neutral ceramidase: sc-404967-ACT

ASAH2 humain code la céramidase neutre, une amidase associée aux membranes qui hydrolyse le céramide en sphingosine et en acides gras libres, contribuant ainsi à l’homéostasie des sphingolipides et à la signalisation des lipides bioactifs. En contrôlant l’équilibre céramide–sphingosine, ASAH2 influence la production en aval de sphingosine-1-phosphate et s’articule avec des voies qui régulent la composition des microdomaines membranaires, l’apoptose, l’autophagie et la signalisation inflammatoire. L’activité d’ASAH2 a été associée au métabolisme lipidique intestinal et épithélial et est fréquemment étudiée dans le contexte de l’adaptation des cellules cancéreuses au stress, du remodelage métabolique et de la biologie de l’inflammation muqueuse. Ces fonctions font d’ASAH2 un point d’entrée utile pour étudier les réseaux de signalisation dépendants du céramide et la régulation du destin cellulaire médiée par les lipides.

neutral ceramidase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ASAH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

neutral ceramidase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ASAH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ASAH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de neutral ceramidase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ASAH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de neutral ceramidase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie neutral ceramidase dans les cellules tumorales présentant une expression de ASAH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.