Neurogenin 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403619-ACT

NEUROG3 (Neurogenin 3) ist ein bHLH-Transkriptionsfaktor (basic helix–loop–helix), der als Masterregulator der Spezifizierung endokriner Zelllinien fungiert – insbesondere während der Pankreasentwicklung, wo er die Festlegung endokriner Vorläuferzellen und deren Differenzierung fördert. Durch die Bindung an E-Box-Motive und die Koordination transkriptioneller Netzwerke mit Signalwegen wie der Notch-vermittelten lateralen Inhibition hilft NEUROG3, das Gleichgewicht zwischen dem Erhalt von Vorläuferzellen und endokrinen Schicksalsentscheidungen zu steuern. Seine Aktivität beeinflusst die Entstehung von Programmen insulin-, glukagon- und somatostatinproduzierender Zellen und steht damit im Zentrum der Forschung zur Bildung der pankreatischen Inseln und zur Identität endokriner Zellen. Eine veränderte NEUROG3-Funktion oder -Expression ist mit angeborenen Störungen der enteroendokrinen und pankreatisch-endokrinen Entwicklung verbunden und wird häufig in Modellen für diabetesbedingte β-Zell-Insuffizienz sowie gastrointestinale endokrine Dysfunktionen untersucht.

Neurogenin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEUROG3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Neurogenin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEUROG3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEUROG3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Neurogenin 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEUROG3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Neurogenin 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Neurogenin 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEUROG3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.