Plasmide CRISPR d'Activation (h) Net: sc-405945-ACT

ELK3 (Net) est un facteur de transcription à domaine ETS qui agit principalement comme répresseur transcriptionnel et, selon le contexte, comme activateur en aval de la signalisation RAS–RAF–MEK–ERK. En formant des complexes ternaires avec le Serum Response Factor (SRF) au niveau des éléments de réponse au sérum, Net intègre des signaux mitogènes et de stress pour réguler les programmes de gènes de réponse immédiate, le remodelage du cytosquelette et les transitions d’état cellulaire. L’activité de Net influence des processus tels que la biologie endothéliale, la migration et l’invasion via la régulation de gènes cibles associés aux sorties transcriptionnelles dépendantes de MAPK. Une expression ou une signalisation d’ELK3 dérégulée a été associée à des programmes oncogéniques, à des phénotypes liés à l’angiogenèse et à un potentiel métastatique, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la progression tumorale et du remodelage vasculaire.

Net Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ELK3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Net Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ELK3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ELK3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Net. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ELK3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Net au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Net dans les cellules tumorales présentant une expression de ELK3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.