Plasmide CRISPR d'Activation (h) Neprilysin-2: sc-405449-ACT

MMEL1 code la néprilysine‑2 (membrane metalloendopeptidase‑like 1), une métalloprotéase dépendante du zinc exprimée à la surface cellulaire et au sein de compartiments endomembranaires, qui contribue au traitement et au renouvellement des peptides. Grâce à une protéolyse régulée de peptides bioactifs, la néprilysine‑2 peut influencer la dynamique de signalisation locale, la composition du microenvironnement extracellulaire et la communication médiée par les récepteurs, reliant l’activité de MMEL1 à la protéostasie et aux réseaux de signalisation inflammatoire. Des études d’association génétique ont relié le locus MMEL1 à des traits à médiation immunitaire et à la neuro‑inflammation, ce qui étaye sa pertinence dans des voies couplant le métabolisme des peptides à la régulation immunitaire. Ces caractéristiques font de MMEL1 une cible utile pour des études mécanistiques de la signalisation dépendante des protéases, de la communication cellule‑cellule et de circuits de régulation pertinents pour les maladies.

Neprilysin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MMEL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Neprilysin-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MMEL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MMEL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Neprilysin-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MMEL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Neprilysin-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Neprilysin-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de MMEL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.