Plasmide CRISPR d'Activation (h) nephrocystin: sc-404375-ACT

NPHP1 code la néphrocystine, une protéine adaptatrice associée aux cils, localisée au cil primaire ainsi qu’aux compartiments du centrosome/corps basal, où elle soutient l’assemblage ciliaire, le trafic intraciliaire et la compétence des voies de signalisation. La néphrocystine coordonne des complexes multiprotéiques impliqués dans la polarité des cellules épithéliales, la mécanoperception et l’organisation du cytosquelette, reliant l’architecture ciliaire à des voies en aval qui régulent la différenciation et l’homéostasie tissulaire. Une altération de la fonction de NPHP1 est fortement associée aux ciliopathies liées à la néphronophtise et à des phénotypes syndromiques résultant d’une signalisation ciliaire et d’une intégrité épithéliale compromises. Par conséquent, NPHP1 est fréquemment étudié dans des modèles de tubulogenèse rénale, de dynamique du transport ciliaire et de relations génotype–phénotype en biologie des ciliopathies.

nephrocystin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPHP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nephrocystin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPHP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPHP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nephrocystin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPHP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nephrocystin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nephrocystin dans les cellules tumorales présentant une expression de NPHP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.