Plasmide CRISPR d'Activation (h) nephrin: sc-400368-ACT

NPHS1 code la néphrine, une protéine transmembranaire de la superfamille des immunoglobulines qui constitue un composant central du diaphragme de fente des podocytes et qui est essentielle à la barrière de filtration glomérulaire. La néphrine participe à l’adhésion cellule–cellule et organise des plateformes de signalisation via des interactions avec des protéines adaptatrices telles que NCK, reliant l’architecture extracellulaire du diaphragme de fente au remodelage du cytosquelette d’actine et à des voies associées à PI3K/AKT. Une altération de l’expression de NPHS1 ou du trafic de la néphrine compromet la structure des podocytes et augmente la perméabilité, ce qui en fait un nœud moléculaire central dans l’étude des mécanismes des néphropathies protéinuriques. Dans les modèles de biologie rénale humaine, NPHS1 est couramment utilisé pour analyser l’état de différenciation des podocytes, l’intégrité de la barrière de filtration et les réponses au stress convergeant vers la régulation du cytosquelette et des jonctions.

nephrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPHS1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nephrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPHS1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPHS1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nephrin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPHS1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nephrin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nephrin dans les cellules tumorales présentant une expression de NPHS1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.