Plasmide CRISPR d'Activation (h) NEPH1: sc-403372-ACT

KIRREL code pour NEPH1, une protéine transmembranaire de la superfamille des immunoglobulines qui constitue un composant central du diaphragme de fente glomérulaire et contribue à une adhésion cellule–cellule spécialisée. NEPH1 participe à des complexes de signalisation en interface avec le cytosquelette d’actine et des protéines adaptatrices, soutenant l’intégrité de la barrière de filtration et la polarité cellulaire des podocytes rénaux. Une expression altérée de NEPH1 ou sa mauvaise localisation est liée à des voies de lésion des podocytes et a été associée à des phénotypes de maladies rénales protéinuriques, notamment certaines formes de syndrome néphrotique. Par conséquent, KIRREL/NEPH1 est largement étudié dans des modèles portant sur le maintien des podocytes, l’organisation des jonctions et le remodelage du cytosquelette en condition de stress.

NEPH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KIRREL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NEPH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KIRREL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KIRREL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NEPH1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KIRREL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NEPH1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NEPH1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KIRREL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.