Plasmide CRISPR d'Activation (h) NELF-A: sc-401058-ACT

NELFA code pour NELF-A, une sous-unité centrale du complexe NELF (negative elongation factor), qui coopère avec DSIF pour instaurer une pause proximale au promoteur de l’ARN polymérase II et réguler l’élongation transcriptionnelle. Grâce à ce point de contrôle, NELF-A contribue à coordonner des programmes géniques rapidement induits par des stimuli, en couplant l’initiation de la transcription à une élongation productive et au traitement des ARN dans le noyau. La pause médiée par NELF influence l’état de la chromatine et la fidélité transcriptionnelle, façonnant des voies impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation et les réponses au stress. Une dérégulation du contrôle de l’élongation transcriptionnelle a été associée à des programmes d’expression génique aberrants dans le cancer ainsi qu’à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui étaye l’utilisation de perturbations de NELFA pour étudier des circuits transcriptionnels pertinents pour la maladie.

NELF-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NELFA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NELF-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NELFA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NELFA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NELF-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NELFA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NELF-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NELF-A dans les cellules tumorales présentant une expression de NELFA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.