Nek9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404971-ACT

NEK9 kodiert die Serin/Threonin-Kinase Nek9, einen zentralen Regulator der Zentrosomenfunktion und des mitotischen Fortschreitens. Nek9 koordiniert den Aufbau des Spindelapparats und die Mikrotubulusdynamik, indem es nachgeschaltete, NIMA-verwandte Kinasen aktiviert und Phosphorylierungsereignisse integriert, die die Zentrosomentrennung, den Eintritt in die Mitose und die Zytokinese steuern. Aufgrund seiner Funktionen in der Zellzykluskontrolle und der Genomstabilität ist eine veränderte NEK9-Aktivität relevant für Untersuchungen zur chromosomalen Instabilität und zu proliferationsassoziierten Phänotypen, wie sie in der Krebsbiologie und bei Entwicklungsstörungen beobachtet werden. NEK9 greift zudem in stressresponsive Signalwege ein, die die Zuverlässigkeit von Checkpoints und den Austritt aus der Mitose beeinflussen können.

Nek9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEK9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nek9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEK9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEK9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nek9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEK9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nek9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nek9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEK9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.