NEDL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410607-ACT

Das humane Gen **HECW2** kodiert die HECT-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase **NEDL2**, einen Regulator der Proteinstabilität und der Signalübertragung durch ubiquitinvermittelten proteasomalen Abbau. NEDL2 ist an der zellulären Qualitätskontrolle und der Modulation von Signalwegen beteiligt, indem es spezifische Substrate zur Ubiquitinierung markiert und dadurch Prozesse wie Zellzykluskontrolle, Stressantworten und Transkriptionsprogramme beeinflusst. Berichte über funktionelle Zusammenhänge verorten HECW2 in der ubiquitinabhängigen Regulation entwicklungs- und neuronaler Signalwege, wobei veränderte Expression oder Variantenallele mit neurodevelopmentalen Phänotypen in Verbindung gebracht wurden. Entsprechend wird HECW2/NEDL2 häufig im Kontext von Proteostase, Signalweg-Crosstalk sowie Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in humanen Zellmodellen untersucht.

NEDL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HECW2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NEDL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HECW2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HECW2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NEDL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HECW2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NEDL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NEDL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HECW2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.