Particules Lentivirales d'Activation (m) NEDD4: sc-421848-LAC

Le gène murin Nedd4 code NEDD4, une ligase E3 de l’ubiquitine à domaine HECT qui régule le renouvellement des protéines et la signalisation en catalysant le transfert d’ubiquitine vers des récepteurs membranaires, des canaux ioniques et des intermédiaires de signalisation. Grâce à la reconnaissance, via ses domaines WW, de substrats portant un motif PY, NEDD4 influence l’endocytose et le trafic des protéines de surface et module des voies telles que PI3K–AKT, TGF-β et la signalisation associée à l’EGFR, avec des effets en aval sur la croissance, la survie et la migration cellulaires. L’activité de NEDD4 s’inscrit aussi à l’interface des réseaux de protéostasie et de réponse au stress, en façonnant le remodelage, dépendant de l’ubiquitine, des complexes de signalisation cellulaires. Une ubiquitinylation dépendante de NEDD4 dérégulée a été impliquée dans des phénotypes pertinents pour la maladie, notamment des altérations du transport épithélial, une signalisation proliférative aberrante ainsi que des dysfonctionnements immunitaires et neuronaux, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques.

Les particules d'activation lentivirales NEDD4 (m) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de Nedd4 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales NEDD4 (m) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription Nedd4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de NEDD4. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif Nedd4 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.