Plasmide CRISPR d'Activation (h) NDST1: sc-404078-ACT

NDST1 code la N‑désacétylase/N‑sulfotransférase 1, une enzyme résidente de l’appareil de Golgi qui catalyse des étapes clés de modification lors de la biosynthèse du sulfate d’héparane, notamment la N‑désacétylation et la N‑sulfatation des résidus de glucosamine. Ces réactions façonnent les profils de sulfatation du sulfate d’héparane, lesquels déterminent la liaison et les réponses de signalisation de facteurs de croissance, morphogènes et chimiokines au sein de la matrice extracellulaire et des protéoglycanes de surface cellulaire. En modulant des voies dépendantes du sulfate d’héparane telles que les signalisations FGF, Wnt, Hedgehog et BMP, NDST1 influence l’adhésion cellulaire, la migration, la différenciation et l’organisation des tissus. Un remodelage dérégulé du sulfate d’héparane a été associé à des programmes de développement altérés et à une signalisation du microenvironnement pertinente pour la biologie du cancer, l’inflammation ainsi que des phénotypes neurologiques et vasculaires, ce qui motive des études mécanistiques sur l’architecture des glycosaminoglycanes contrôlée par NDST1.

NDST1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NDST1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NDST1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NDST1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NDST1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NDST1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NDST1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NDST1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NDST1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NDST1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.