Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ndfip2: sc-405125-ACT

NDFIP2 (Ndfip2) code un adaptateur de membrane endosomale qui se lie aux ligases E3 à domaine HECT de la famille NEDD4 et les active, contribuant à orienter les cargaisons ubiquitinylées à travers l’endocytose et leur dégradation associée aux lysosomes. Par ces interactions, Ndfip2 participe à la régulation dépendante de l’ubiquitine de l’abondance des protéines membranaires, du trafic vésiculaire et des sorties de signalisation liées aux réponses cellulaires au stress. L’expression de NDFIP2 a été étudiée dans des contextes immunitaires et épithéliaux, où le contrôle médié par l’ubiquitine de la dynamique des récepteurs et des transporteurs peut moduler les programmes d’inflammation, de survie et de différenciation. La dérégulation du trafic endolysosomal et des réseaux de ligases de l’ubiquitine est largement pertinente pour la biologie du cancer et les mécanismes neuro-immuns, ce qui fait de NDFIP2 un nœud utile pour des études centrées sur des voies de signalisation.

Ndfip2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NDFIP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ndfip2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NDFIP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NDFIP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ndfip2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NDFIP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ndfip2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ndfip2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NDFIP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.