NCK1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h): sc-402220

Übersicht

Humanes NCK1 (nichtkatalytische Region des Tyrosinkinase-Adaptorproteins 1) ist ein SH2/SH3-Domänen-Adaptor, der aktivierte Rezeptor- und Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen mit nachgeschalteten Effektoren koppelt, die den Umbau des Aktinzytoskeletts und die Signaltransduktion steuern. Durch die Verknüpfung phosphotyrosinbasierter Signale mit Proteinen wie PAK und Regulatoren der WASP-Familie trägt NCK1 zur Koordination von Signalwegen bei, die an Zellmigration, Adhäsionsdynamik, Endozytose und Stressantworten beteiligt sind. Das von NCK1 vermittelte Scaffoldingsystem überschneidet sich mit Wachstumsfaktor-Signalnetzwerken, einschließlich EGFR-assoziierter Kaskaden, und trägt durch den Aufbau von Multiproteinkomplexen zur Regulation MAPK- und PI3K-abhängiger Prozesse bei. Eine Fehlregulation dieser Signalmodule wurde mit veränderter Motilität und invasiven Phänotypen in der Krebsbiologie in Verbindung gebracht, ebenso wie mit weiterreichenden Störungen der Zytoskelett-Homöostase, die für Entwicklungs- und Entzündungskontexte relevant sind.

NCK1 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des NCK1-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des NCK1-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das NCK1 HDR-Plasmid (h) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte NCK1 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem NCK1 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das NCK1 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des NCK1-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf NCK1 Exon(e) abzielt, die für die NCK1 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.