Plasmide CRISPR d'Activation (m) Na⁺ CP type IIIα: sc-422820-ACT

Scn3a code la sous-unité alpha du canal sodique voltage‑dépendant Na+ CP de type IIIα (Nav1.3), une protéine membranaire formant un pore qui initie et propage les potentiels d’action en médiant un influx rapide de sodium. Dans les neurones de souris, Nav1.3 contribue à l’excitabilité intrinsèque et au timing des décharges, en s’intégrant à des programmes de signalisation électrique qui coordonnent la transmission synaptique et l’activité des réseaux neuronaux. Les courants sodiques régulés par SCN3A influencent des processus dépendants de l’activité tels que la croissance des neurites et la maturation des circuits, et des altérations de l’expression du canal ou de sa cinétique d’ouverture/fermeture ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et liés aux crises. En conséquence, Scn3a est largement étudié dans des modèles de troubles de l’excitabilité, de traitement sensoriel et de différenciation neuronale.

Na+ CP type IIIα Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Scn3a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Na+ CP type IIIα Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Scn3a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Scn3a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Na+ CP type IIIα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Scn3a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Na+ CP type IIIα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Na+ CP type IIIα dans les cellules tumorales présentant une expression de Scn3a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.