Plasmide CRISPR d'Activation (h) NALCN: sc-403432-ACT

NALCN code la protéine du canal de fuite sodique non sélectif, un composant membranaire formant un pore qui assure une conductance de fond du Na+ indépendante du voltage et contribue à établir le potentiel de membrane au repos ainsi que l’excitabilité intrinsèque des neurones et d’autres cellules excitables. En ajustant la force dépolarisante de base, la fonction de NALCN s’inscrit à l’interface de réseaux de signalisation qui régulent l’activité rythmique, l’intégration synaptique et le contrôle homéostatique du potentiel de membrane. Une activité ou une expression dérégulée de NALCN a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neuromoteurs, notamment des troubles du rythme respiratoire et une hypotonie, reflétant son rôle dans le fonctionnement de circuits dépendants de l’excitabilité. Dans des modèles cellulaires humains, la modulation de NALCN constitue un levier pratique pour étudier l’électrophysiologie membranaire, la régulation des canaux ioniques et les réponses transcriptionnelles en aval induites par des changements d’excitabilité.

NALCN Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NALCN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NALCN Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NALCN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NALCN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NALCN. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NALCN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NALCN au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NALCN dans les cellules tumorales présentant une expression de NALCN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.